摘要：生物固氮是自然生態系統中氮的主要來源全球生物固氮的量是巨大的，海洋生態系統每年生物固氮量在四百萬噸到兩千萬噸，陸地生態系統生物固氮量在九百萬噸到一千三百萬噸，而工業固氮量在世紀年代中期每年約為一千三百萬噸。可見，生物固氮在農林業生產和氮素生態系統平衡中的作用很大我國農民利用豆科植物固氮肥田歷史悠長，直至現在仍保留着豆科植物和非豆科植物輪作套作和間作等耕作制度國外也十分重視固氮生物在農業中的作用。
關鍵詞：生物固氮；聯合固氮菌；自生固氮菌
一、生物固氮的原理
1982年，Postage以肺炎克氏菌為例提出一個固氮酶催化機理模式，至今仍被廣泛採用其總反應式為：N2+6H++nMg-ATP+6e-(酶)→2NH3+nMg-ADP+nPi固氮微生物的固氮過程是在細胞內固氮酶的催化作用下進行的不同固氮微生物的固氮酶，其催化作用的情況基本相同在固氮酶將還原成的過程中，需要e和H+，還需要ATP提供能量生物固氮的過程十分複雜[1]，簡單地説，即在ATP提供能量的情況下，e和H+通過固氮酶傳遞給N2，使它們還原成NH3，而乙炔和N2具有類似的接受e還原成乙烯的能力。
二、固氮微生物的種類
固氮微生物多種多樣，不同的劃分標準滿足了不同的要求。從它們的生物固氮形式來分，有自生固氮、聯合固氮、和共生固氮3種。
①自生固氮微生物是指能夠在自由生活狀態下固氮的微生物總稱。在自然界，自生固氮微生物種類很多，分散地分佈在細菌和藍細菌的不同科、屬和不同的生理羣中；並大致可以分為光合細菌和非光合細菌兩類。前者如紅螺菌、紅硫細菌和綠硫細菌等，其中的某些種類可與其它微生物聯合而相互有利；後者的種類很多。根據非光合細菌的自生固氮菌對氧的需求，可以分為厭氧的細菌如梭狀芽胞桿菌[2]；需氧細菌如自生固氮菌、貝捷林克氏固氮菌、固氮螺菌等；以及兼性細菌如多粘芽胞桿菌、克魯伯氏桿菌、腸桿菌等。自生固氮微生物中的某些種類，在有些情況下可以與植物進行聯合固氮。
一般地，自生固氮微生物固定的氮素滿足本身生長繁殖需要以後就不再固氮了，多餘的氮反過來會抑制它們自身的固氮系統。同時，它們固氮效率也比較低。
據測定，每消耗1克碳水化合物，自生固氮微生物固定10毫克氮，而共生固氮的根瘤菌則可以固定270毫克氮。所以，這個類羣的微生物從固氮量的角度衡量，對作物的氮素供應的貢獻並非很大。許多試驗結果證明，這類微生物所產生的各種激素和其它活性物質是促進作物生長的主要因素之一。
②聯合固氮微生物有些自生固氮微生物在特定植物根際環境中生長、繁殖比非根際土壤中旺盛得多，這是由於植物根系的分泌物和脱落物提供能源物質，固氮微生物利用這些能源物質生活和固氮，這種互利關係稱之為聯合固氮。聯合固氮體系最先是在雀稗和雀稗固氮菌之間發現，後來發現小麥、水稻和C4作物如甘蔗、玉米、高粱等禾本科植物亦存在聯合固氮體系。能夠進行聯合固氮的微生物種類較多，似乎沒有什麼特異性[2,3]，有些微生物既可以在自生條件下進行自生固氮作用，又能在田間與一些禾本科作物進行聯合固氮作用。已經報道過的聯合固氮的主要微生物種類有：浸麻芽胞桿菌、多粘芽胞桿菌、巴西固氮螺菌、含脂固氮螺菌、克魯伯氏桿菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌和糞產鹼桿菌等。與共生固氮相比，聯合固氮微生物與植物之間的關係不緊密，雙方也沒有共同的組織結構，因而固氮效率也不可能高。目前，對於聯合固氮體系的固氮量很難有一個比較準確的估計，一般認為每畝地每年約為0.5～1斤純氮。
③共生固氮微生物是指能與宿主植物形成特定固氮組織結構的一類微生物。它們彼此生活在一起，植物向微生物提供光合產物供微生物固氮需要，微生物則向植物提供氮素營養，雙方互相有利。以豆科植物--根瘤菌共生體系來説，由於有根瘤組織作為它們的共生結構，共生效率是最高的。其原因是這種共生體系滿足了上述所説的生物固氮的條件。已知的比較清楚的共生體系除了豆科植物--根瘤菌共生體系外，還有非豆科植物--固氮放線菌體系和紅萍--固氮藍藻共生體系。與相應的豆科植物共生固氮的根瘤菌很多，迄今從豆科植物根瘤中分離出來並進行過研究的約有100多種，在生產上應用的種類不足1/5。在分類上確定了分類地位的現在有5個屬，它們分別是：根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、中華根瘤菌屬、固氮根瘤菌屬和中慢生根瘤菌屬。每個根瘤菌屬包括至少1個種。和上述的自生固氮和聯合固氮比較，共生固氮效率高，固氮量多，對於人類的意義和農牧業生產的作用也最大[4]。迄今研究最為清楚、應用最多的是豆科植物根瘤菌共生固氮體系，據測定，一般每年每畝固定純氮約為13.3公斤，約摺合每畝地每年固定標準化肥130斤，且幾乎全部被利用。
三、當前生物固氮的主要研究方法有哪些
在固氮生物研究中，最經典的測定技術是凱氏定氮法其後，由於同位素示蹤法的出現，採用了15N示蹤法測定固氮量，比凱氏法的靈敏度提高1000倍。1966年以來，應用乙炔還原法測定固氮酶活性是生物固氮研究中的一大突破，這一革新把生物固氮研究推向了一個新的階段其靈敏度比15N示蹤法還要高1000倍，而且方法簡單速度快，適於生物固氮方面研究，氮累計法該方法在生物固氮早期研究中成功運用過，但準確率較低。
示蹤法：在固氮研究中，目前15N穩定性同位素被認為是最有效而實用的工具。15N示蹤法的靈敏度比常規凱氏定氮法高1000倍，且不需校正因子但其缺點是：（1）15N的價格較昂貴，需用較為複雜的質譜儀測定；（2）測定的手續較繁瑣，不易準確定量；（3）其靈敏度較乙炔還原法低1000倍。該方法是用塑料袋先將植物封住，抽出裏面的空氣，導入高丰度的15N，經過一段時間後取出樣本，用凱氏定氮法消化蒸餾，用Hg2+或CUSO4作催化劑，把15N轉化為15NH4，在高真空中用次溴酸鹽將15NH4轉化為15N2，直接導入質譜儀中進行分析[5]。
同位素稀釋法：同位素稀釋質譜法是通過同位素丰度的精確質譜測量和所加入稀釋劑的準確稱量，求得待測樣品中某元素的絕對量，有效地把元素的.化學分析轉變為同位素測量，因此具有同位素質譜測量的高精度和化學計量的高準確度但其缺點非常明顯：（1）需要濃縮同位素，成本高；（2）樣品製備複雜，花費時間長，易受污染乙炔還原法1966年，RSchoollhorn和RHBurris以及澳大利亞Murdoch大學的MJDilworth發現固氮酶可以使乙炔還原為另一種氣體---乙烯年等用這種方法對自生固氮菌固氮酶提取液大豆根瘤等做了測定也對大豆根瘤進行了測定1968年，乙炔還原法測定活性已成為國際上固氮研究中最重要的測定技術乙炔還原法靈敏度高，比示蹤法高1000倍，而且方法簡單速度快除此之外，它還可進行生物固氮各方面的研究如自生固氮菌細胞或酶的提取液豆科或非豆科根瘤藻類禾本科植物根際聯合固氮等等它可以離體測定，也可以整株活體連續測定或原位測定該方法是將待測材料置於容器中，注滿乙炔，反應一定時間後，用氣相色譜儀測定乙烯的生成量，以單位時間內一定量樣品所產生的乙烯量來表示固氮酶活性此法速度快，靈敏度高這一方法的建立使生物氮研究方法取得了重
要突破[6,7,8]。
15N自然丰度法：自確定用大氣中15N丰度作為的標準自然丰度以來，利用
15固氮植物和非固氮植物利用有效氮源的不同而形成的植物N丰度的差異來測
定生物固氮量，已逐漸成為一種應用範圍較廣的定量研究生物固氮手段，即自然丰度法這是目前國際上日益受到重視的一種方法，精度和同位素稀釋法接近，但成本便宜。
四、聯合固氮菌目前的研究進展及未來研究方向
聯合固氮菌是固氮生物中重要的類羣，在為植物特別是糧食作物提供氮素、降低化肥用量、減少環境污染、維持生態平衡和促進農業可持續發展等方面發揮着重要作用，並因此成為國內外學者研究的熱點。由於聯合固氮細菌與植物之間是一種鬆散的結合，未能形成穩定的共生結構，因而受根際土壤因素的影響較大，這也給聯合固氮菌的研究帶來一些困難。目前聯合固氮作用研究主要有以下方面:①聯合固氮菌的鑑定及其在植物根部的定位觀察。②對聯合固氮體系建立過程中的形成機理和根際微生態系統中植物、土壤和細菌三者間的作用機理的闡明。③由於結合態氮是抑制固定大氣氮的主要因素，如何獲得能高效固氮的耐銨型菌株是亟待解決的問題之一[9]。④聯合固氮菌之間的相互關係及協同作用。⑤將聯合固氮菌引入禾本科植物根內，誘導植物形成固氮根瘤。⑥固氮能源的供給及組成。雖然聯合固氮的固氮效應不及共生固氮高，但其分佈廣，受益作物多，因此對於非豆科植物而言[11,12]，聯合固氮可能成為將來農、林、牧業中潛在的穩定氮源，其生態意義和經濟效益都是不可低估的。
五、自生固氮菌目前的研究進展及未來研究方向
有些高等植物與菌根真菌共生形成菌根，非豆科固氮植物固氮能力強，是陸地生態系統中重要的供氮系統，植物內生菌與寄主植物在長期的共同進化過程中形成共生關係[13]。它們通過固氮作用，產生生理活性物質促進宿主對環境的適應，在農業中具有重要的應用潛力。近年來，在甘蔗、玉米中發現了多種具有固氮功能的內生細菌，引起了學術界的高度關注。
這一發現不僅對生物固氮調控有重要意義，也是對基因表達調控的基礎研究中的一項重要貢獻。它為進一步研究光合和固氮之間的聯繫，提供了理論基礎。
如果固氮微生物體內具有氫酶，可以吸收氫產生的能量。這樣，就能提高其
固氮效率而增加產量。
目前，利用基因工程技術轉移固氮基因從而使植物表達固氮作用已成為一項世界性的戰略課題。許多國家的科學家都在運用現代生物技術從事固氮菌的固氮機理和轉移微生物固氮能力等各方面的研究，展現固氮菌生物固氮的前景。針對目前固氮菌研究中存在的問題，目前關於固氮菌的發展主要集中在以下幾個方面
[14]：
1、改進現有固氮微生物的固氮效率
改變固氮酶作用中的放氫耗能反應。由於固氮作用要消耗一定的能量，即消耗了植物光合作用的產物。因此可以設想，應用基因工程手段，組建菌株，使釋放的能量再用於固氮酶的固氮作用[8]。培養菌株，解除抑制固氮酶合成，使固氮菌環境中能結瘤固氮。
2、利用生物工程技術，構建新的固氮微生物
原核生物間的遺傳性能轉移是比較容易的。應用質粒轉移培育高效固氮的根際細菌羣，開闢根際細菌轉人固氮質粒的研究[15,16]。
3、建立新的共生固氮體系
共生固氮體系是生物界中最有效的固氮組合。固氮作用所需要的能量來自宿主植物的光合作用。固氮產物直接為宿主的氮素營養，共生的兩方面相互有利，相互支持。但是，對農、林和牧業生產有價值的共生固氮體系，在自然界中僅限於少數微生物與有限的豆科植物共生。研究擴大根瘤菌的共生範圍，使能在其它植物上結瘤固氮。或將固氮基因導入高等植物細胞，創建能固氮的高等植物，自給氮素營養的植物類型是非常有意義的。
4、加強固氮菌遺傳工程的研究
從目前的研究現狀來看，試圖通過基因工程將固氮基因(nif)從豆科植物轉移到非豆科農作物中難度比較大，在短期內很難實現，而採用細胞工程方法將根瘤菌導入非宿主農作物細胞內則切實可行[17,18,19]。
5、建立新的共生固氮體系
由於Frankia菌具有對宿主的侵染範圍寬、固氮活性比較強和對氨氣不敏感等特性，在生物固氮研究中對Frankia茵的研究將更為重要，有可能由此會找到新的突破口。在Frankia菌與農作物之間建立起新的共生固氮體系將具有更大的的可能性。
隨着生物科學的快速發展和對環境保護的日益重視，固氮菌必將引起更多的關注與研究，固氮微生物在農業發展、環境保護、工業生產等方面的應用將更加深入的展開，人類也將從中獲益匪淺。
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