生物分離實驗案例

實驗一：牛乳中酪蛋白的提取

一、實驗目的

1、掌握等電點法提取蛋白的基本原理及基本操作；2、掌握雙縮脲法測定蛋白含量的基本原理及基本操作。

二、實驗原理

酪蛋白是乳蛋白質中最豐富的一類蛋白質，約佔乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是單一的蛋白質，是一類含磷的複合蛋白質混合物，以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相結合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量約為35g/L，比較穩定，利用這一性質，可以檢測牛乳中是否摻假。

酪蛋白在其等電點時由於靜電荷為零，同種電荷間的排斥作用消失，溶解度很低，利用這一性質，經牛乳調到pH4.6，酪蛋白就從牛乳中分離出來。酪蛋白不溶於乙醇，這個性質被利用來從酪蛋白粗製劑中將脂類雜質除去。

在乳製品加工或成品中，酪蛋白含量是一個常需測定的指標。常用於測定酪蛋白的方法是先將酪蛋白在等電點沉澱，再用凱氏定氮法測定。本實驗採用雙縮脲法測定酪蛋白。其原理為：蛋白質含肽鍵，肽鍵在鹼性溶液中可與銅離子形成紫紅色化合物，在540nm波長處有最大吸收，其顏色深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸組成無關。

三、材料與試劑

市售牛奶

10mg/mL酪蛋白標準溶液（用0.1MNaOH配製）0.1MNaOH溶液、0.2MpH4.6的HAc－NaAc緩衝液

雙縮脲試劑：稱取硫酸銅（CuSO4·5H2O）1.5g，加水100mL，加熱助溶；另稱取酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）6.0g、碘化鉀5g溶於500mL水中。兩液混勻後，在攪拌下加入10%NaOH300mL，後用水稀釋至1000mL，貯存於塑料瓶中。此液可長期保存，若瓶底出現黑色沉澱則需重新配製。

四、操作步驟

1、牛乳中酪蛋白的等電點沉澱

用量筒量取25mL牛乳兩份分別置於50mL燒杯中，水浴加熱至40℃，在攪拌下慢慢加入到已預熱至40℃的等體積的0.2MpH4.6的HAc－NaAc緩衝液中，混勻，冷卻靜置30min沉澱酪蛋白後，3000r/min離心15min，棄上清液，收集沉澱。一份沉澱用於“除雜”步驟，另一份沉澱用0.1MNaOH溶液溶解並定容至100mL，用於“酪蛋白含量測定”步驟。

2、除雜

將上述沉澱搗碎，加入10mL95%乙醇，攪拌製成懸浮液。將此懸浮液傾於布氏漏斗中，抽濾除去乙醇溶液，再用10mL乙醚－乙醇混合液（1∶1）洗滌沉澱兩次，最後再用10mL乙醚洗滌沉澱兩次，抽乾。

將沉澱從布氏漏斗中移去，在表面皿上攤開揮幹乙醚後，置烘箱中80℃乾燥過夜，稱重（m1）。

3、酪蛋白含量測定

（1）標準曲線的繪製

分別移取酪蛋白標準液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL於乾燥試管中，不足1.0mL者用0.1MNaOH

溶液補足1.0mL，然後分別加入4.0mL雙縮脲試劑，混勻，室温下反應30min，測定540nm波長處吸光度。以酪蛋白質量（mg）為橫座標、吸光度為縱座標繪製標準曲線。（2）酪蛋白含量測定

取?步驟1‖中樣品溶液1.0mL，加入4.0mL雙縮脲試劑，混勻，室温下反應30min，測定540nm波

長處吸光度，查標準曲線，求得酪蛋白質量。平行測定3次，求其平均值，並計算25mL牛乳中酪蛋白的質量（m2）。

五、結果與討論

1、牛乳中酪蛋白含量的計算

含量（g/mL）=

2、酪蛋白提取得率的計算

得率（%）=

m2?100

牛乳體積（25mL）

m1

?100%

m2?100

六、思考題

1、為什麼在等電點沉澱時需加熱至40℃？2、除雜時，能否將三種溶劑的順序顛倒？為什麼？3、雙縮脲法測定蛋白的原理是什麼？

4、比較牛乳中酪蛋白測定含量與理論含量大小，並對測定結果進行討論。

實驗二：大蒜細胞SOD酶的提取與分離

一、實驗目的

1、掌握SOD酶的提取、分離、檢測等一般步驟；

2、掌握酶在提取過程中的兩個重要參數：回收率和純化倍數。

二、實驗原理

超氧化物歧化酶（SOD）是一種就有抗氧化，抗衰老，抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可以催化超氧負離子（O-）進行歧化反應，生成氧和過氧化氫：2O2-+H2→O2+H2O2.大蒜蒜瓣和懸浮培養的大蒜細胞中含有較豐富的SOD，通過組合組織或者細胞破碎後，可用PH7.8的`磷酸緩衝液體提取。由於SOD不溶於丙酮中，可用丙酮將其沉澱析出。

鄰苯三酚在鹼性條件下可迅速自氧化,釋放出O2-,生成帶色的中間產物,在325nm有最大吸收峯。鄰苯三酚自氧化產生的中間產物在40s-3min這段時間，生成物與時間有較好的線性關係。顏色深→SOD逐漸增多→顏色淺，即酶活力越大，顏色越淺。

三、試劑和材料

新鮮蒜瓣，市售

磷酸緩衝液：0.05mol/L，pH7.8

氯仿一乙醇混合溶劑：氯仿?無水乙醇=3?5（V/V）丙酮：用前冷卻至4～10℃

0.1mol/LTris—HCl緩衝液（pH=8.2,內含2mmol/LEDTA）10mmol/LHCl

45mmol/L鄰苯三酚（內含10mmol/LHCl）

四、實驗步驟

1、組織或細胞破碎

稱取5g左右大蒜蒜瓣，置於研缽中研磨，使組織或細胞破碎。2、SOD的提取

將上述破碎的組織或細胞，加入2～3倍體積（10-15mL）的0.05mol/L，pH7.8的磷酸緩衝液，繼續研磨攪拌20min，使SOD充分溶解到緩衝液中，然後在5000r/min下，離心15min，收集上清液得提取液。

留出1mL備用，剩餘提取液準確量取體積後進行下步實驗。3、除雜蛋白

提取液加入0.25倍體積的氯仿一乙醇混合溶劑攪拌15min，5000r/min離心15min，去雜蛋白沉澱，收集上清液得粗酶液。

留出1mL備用，剩餘粗酶液準確量取體積後進行下步實驗。4、SOD的沉澱分離

將上述粗酶液加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，5000r/min離心15min，得SOD沉澱。

將SOD沉澱溶於少量（5ml）0.05mol/LpH7.8的磷酸緩衝液中，再加水5mL，5000r/min離心15min，收集上清液，得SOD酶液。準確量取體積。

將上述提取液、粗酶液和酶液分別取樣，測定各自的SOD活力和蛋白濃度。5、SOD活力測定

參照李建武的《生物化學實驗原理和方法》，採用鄰苯三酚自氧化法測定SOD的酶活力。鄰苯三酚在鹼性環境中即可迅速發生自氧化作用，在自氧化過程中產生有色中間物和O2-自由基，反應開始後溶液逐漸變成黃色，在有超氧化物歧化酶存在時，由於它能催化O2-自由基與+H結合生成02和H2O2，從而阻止了中間產物的積累，降低了自氧化速率。中間產物在325nm時有強力的光吸收，採用分光光度計即可檢測。

（1）鄰苯三酚自氧化速率的測定：

在試管中按表1加入各試劑，加入鄰苯三酚後馬上計時，迅速搖勻倒入石英比色皿中，在325nm波長下，從第1分鐘開始，每隔30秒測一次光吸光度，測至第5分鐘。以吸光度為縱座標，反應時間（min）為橫座標繪製反應曲線，計算鄰苯三酚自氧化速率k0（直線斜率）。

表1鄰苯三酚自氧化測定加樣表

試劑

0.1mol/LTris—HCl緩衝液（pH=8.2,內含2mmol/LEDTA）

蒸餾水10mmol/LHCl

45mmol/L鄰苯三酚（內含10mmol/LHCl）

總體積

加樣量（mL）校零管——9.0

測定管4.54.4——0.19.0

（2）SOD酶活的測定：

在試管中按表2加入各試劑，加入鄰苯三酚後馬上計時，迅速搖勻倒入石英比色皿中，在325nm波長下，從第1分鐘開始，每隔30秒測一次光吸光度，測至第5分鐘。以吸光度為縱座標，反應時間（min）為橫座標繪製反應曲線，計算加入SOD酶樣品後的鄰苯三酚自氧化速率k1（直線斜率）。

表2SOD酶活測定加樣表

試劑

0.1mol/LTris—HCl緩衝液（pH=8.2,內含2mmol/LEDTA）

蒸餾水10mmol/LHCl待測樣

45mmol/L鄰苯三酚（內含10mmol/LHCl）

總體積

加樣量（mL）校零管——9.0

測定管4.54.3——

（3）酶活力測定

酶活性單位定義為：在lml的反應液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定義為一個

活力單位。

按下式計算樣品中SOD酶單位活力：

k0-k1樣品液稀釋倍數

?50%?反應液總體積?

加入樣品液體積單位體積活力（U/ml）=k0

活性單位定義體積

總活力（U）=單位體積活力?樣品液總體積

式中：反應液總體積=9mL；樣品液稀釋倍數=1；加入樣品液體積=0.1mL；活性單位定義體積=1mLl；樣品液總體積=實驗中各樣品實測體積。6、樣品中可溶性蛋白含量的測定

從1mL備用的提取液、粗酶液、酶液中分別取0.2mL、0.4mL、0.5mL，按提取液50倍、粗酶液20倍、酶液10倍進行稀釋，分別測定稀釋液在260nm和280nm波長處的吸光值，按下式計算可溶性蛋白的含量：

蛋白質濃度(mg/mL)=(1.45A280?0.74A260)×稀釋倍數

總蛋白（mg）=蛋白質濃度×樣品液總體積

五、結果與討論

將試驗結果及相應的計算結果填入下表：

相關計算公式：

力力；回收率=粗酶液（或酶液）總活比活力U/mg=總活力（U）；純化倍數=粗酶液（或酶液）比活

提取液總活力提取液比活力總蛋白（mg）

六、思考題

1、在SOD酶提取步驟中應注意的關鍵問題是什麼？2、綜合評價蛋白或酶的提取分離流程優劣的指標有哪些？

實驗一：茶多酚標準曲線的測定

儀器：紫外分光光度計，比色皿，天平，容量瓶，移液管，pH計、試管

藥品：沒食子酸丙酯或茶多酚，酒石酸鉀鈉，硫(轉載於:g沒食子酸丙酯，蒸餾水溶液，移入25mL容量瓶並稀釋至刻度，搖勻，配製成1mg/mL的標準溶液

A酒石酸亞鐵溶液配製

準確稱取0.1g硫酸亞鐵，和0.5g酒石酸鉀鈉，混合，蒸餾水溶解後移入100mL容量瓶，稀釋至刻度，搖勻。

pH7.5磷酸鹽緩衝液配製

磷酸氫二鈉：準確稱取分析純磷酸氫二鈉2.969g，蒸餾水稀釋溶解，移入250mL容量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，為a液

磷酸二氫鉀：準確稱取分析純磷酸二氫鉀，、2.2695g，蒸餾水溶解，移入250mL容量瓶，定容，B。

取A液體85mL，B液體15mL混合均勻，即成。

B標準曲線繪製

分別吸取0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25mL的沒食子酸丙酯標準液於25mL容量瓶中，加入蒸餾水4mL，再加入酒石酸亞鐵溶液5mL，用pH7.5的磷酸鹽緩衝溶液稀釋至刻度，搖勻，分光光度計在540nm處，1cm比色皿，分別測定吸光度。空白參比操作同上，不加沒食子酸丙酯。以容量瓶中沒食子酸丙酯的絕對含量mg為橫座標，吸光度為縱座標，繪製標準曲線，做線性迴歸。

C樣品測定

取適量樣品加入容量瓶，操作同上，沒食子酸丙酯含量乘以換算係數1.5，求得茶多酚。

實驗二超聲法和迴流法提取茶多酚的比較

實驗儀器：

超聲提取器、布氏漏斗、抽濾瓶、真空泵、燒瓶、量筒、分光光度計、比色皿、容量瓶等、實驗試劑

茶葉、純淨水、茶多酚（沒食子酸丙酯）、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等

操作方法

1、材料準備

稱取一定量的茶葉，研缽粉碎。備用

2、提取

A、超聲提取法

稱取5g粉碎後茶葉末，放入燒瓶（塑料袋密封），加入100mL水，於超聲提取器，50℃提取20min，抽濾，定容至100mL，待測。

B、迴流提取法

稱取10g粉碎後茶葉末，放入圓底燒瓶，加入100mL水，80℃提取40min，分別在1、3、5、7、10、15、20、30、40min取3mL樣品，小漏斗過濾後，待測。測得茶多酚含量（mg/mL）以茶多酚含量為縱座標，時間為橫座標繪製曲線。

3.含量測定

按照標準曲線的方法測定含量。

所需試劑及儀器

試劑：

沒食子酸丙酯或者茶多酚，酒石酸鉀鈉，硫酸亞鐵，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，

儀器：

紫外分光光度計，水浴鍋，電子天平，pH計，超聲提取器，量筒（100mL*1），容量瓶（25mL*8，100mL*4,250mL*2），比色皿*5，移液管（1.0mL*2,0.5mL*2,2mL*2,5mL*4）三角瓶250mL*2，小漏斗*2，試管架