航天誘變鳳仙花種子抗菌肽純化分析

1 材料

航天誘變鳳仙花種子（SP4）由西華師範大學生命科學學院湯澤生教授提供。供試菌株：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和大腸桿菌（Escherichia coli）由實驗室保存；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）購自於中國科學院微生物研究所菌種保存中心，綠膿桿菌（ginosa）由四川省綿陽市第三人民醫院呼吸科提供。

2 方法

2.1 粗提物的收集及抑菌作用稱取適量航天誘變鳳仙花幹種子，磨成粉末，採用磷酸緩衝液於4℃冰箱浸提24 h後離心取上清液。沉澱反覆浸提數次，合併上清液，於4℃採用硫酸銨（80%飽和度）鹽析收集沉澱的蛋白質，並透析脱鹽，獲得種子總蛋白質。將種子總蛋白溶液用枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌做抑菌實驗。

2.2 抗菌肽的初步純化採用Millipore小型切向流超濾系統對脱鹽後的蛋白質進行初步分離，選用使用截留量為50 KD，10 KD和5 KD的膜包經過3次分級分離，獲得了抗菌肽粗提物。將上述各提取物上樣C18柱，以99.9%乙腈和0.1%三氟乙酸TFA為洗脱液，以3.0 ml·min-1的流速進行洗脱，紫外檢測儀器檢測其OD210處的吸光值。收集具有抑菌活性的樣品冷凍真空乾燥至粉末，－20℃保存。同時參考孫雪文等［8］的方法，採用改進的Tricine-SDS-PAGE電泳系統檢測每步產品的分子量並進行抑菌試驗。

2.3 抗菌肽的純化用0.2 μm的一次性濾頭對超濾分離出來的分子量小於5 KD的小分子蛋白質樣品進行過濾，除去不溶性雜質。再採用安捷倫C18製備柱進行抗菌肽的純化，流動相99.9%乙腈與0.1%三氟乙酸TFA，流速3.0 ml·min-1，柱温23℃。用紫外檢測器在波長為210 nm下測紫外吸收值。收集各峯，冷凍真空乾燥至粉末。將凍幹品稀釋後做抑菌試驗，有抑菌活性的峯就含有抗菌肽。

2.4 抗菌肽抑菌活性的測定採用紙片法來進行抑菌活性檢測。細菌培養基為LB固體培養基。菌種為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌。在直徑為10 cm的平皿內傾倒培養基；待平板冷卻，吸取調整好濃度的，處於對數生長期的供試菌懸液100 μl於平板上，用無菌塗布器均勻塗布於平板表面。每種供試菌塗布兩個平板，每個平板貼4張直徑為6 mm的無菌紙片，其中兩片加滴加20 μl抗菌肽樣品，另外兩片滴加無菌水作對照。在37℃培養24 h（綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌的培養温度為24℃），測量各抑菌圈直徑，以表示抗菌活性。

2.5 抗菌肽的電泳檢測以分子量73，50，35，25，16，8，2 kDa蛋白質為標準蛋白。因此本課題組參考孫雪文等［8］的方法，採用改進的Tricine-SDS-PAGE電泳系統，對提取的小分子多肽的分子量進行檢測。

3 結果

3.1 蛋白質粗提結果由圖1可以看出，蛋白質粗提物中含有多種蛋白質，其中在29 KD附近存在有染色較深的條帶，説明粗提物中含有小分子蛋白質，且含量較高。圖1中條帶2～5是第1次超濾，用50 KD的膜包截留得到的分子量小於50 KD的蛋白質。

3.2 抗菌肽超濾初步純化結果經過超濾對種子總蛋白質進行初步分離，得到的分子量小於5 KD的小分子蛋白質樣品進行電泳檢測，分別用考馬斯亮藍和硝酸銀染色法對凝膠進行染色，在2 KD左右都可以清楚的看到一條清晰的小分子蛋白質條帶，在圖上還出現了8 KD以上的'蛋白質條帶，這是由於5 KD超濾膜在截留的過程中，在壓力的作用下，5 KD的膜包可以通過3倍分子量以上的蛋白質。

3.3 抗菌肽純化結果對超濾得到的小分子蛋白質採用高效液相再進行分離純化。

①首先採用C18製備柱來分離分子量小於5 KD的蛋白質，根據峯的情況，分段蒐集分離出來的物質，凍幹，溶於無菌蒸餾水中。經過Tricine-SDS-PAGE電泳和抑菌活性鑑定後發現，蒐集的a-b段在2 KD左右有條帶，也具有抑菌活性。由於超濾分離出來的小分子蛋白質雜質太多，需要進一步純化a-b段物質。

②按照高效液相第1次製備的方法對蒐集的a-b段進行再純化，結果見圖2，可知第2次分離製備的蛋白質相對較純，雜質含量少。蒐集主峯，然後進行電泳及抑菌活性檢測，檢測發現主峯分子量在2KD左右，且具有抑菌活性。抑菌活性檢測結果與分析抑菌實驗結果見表1。結果表明，從航天誘變鳳仙花種子中提取出的低分子量蛋白質對金黃色葡萄桿菌、綠膿桿菌有明顯的抑菌作用，且抑菌作用持續時間較長；分別觀察48 h和72 h後，抑菌圈沒有被感染。對大腸桿菌抑菌效果不太明顯，抑菌圈較小，對枯草芽孢桿菌幾乎沒有抑菌作用。